一. 实验的目的和要求:
1． 深入理解基因工程的技术流程
2． 学习利用PCR技术从植物基因组中分离基因的方法及凝胶电泳技术
3． 学习利用T－载体对PCR产物进行连接构建表达载体的方法
4． 学习利用热激法进行大肠杆菌的遗传转化
5． 学习转化后细胞的培养与转化子筛选
6． 学习转化子鉴定的方法
二. 实验条件：
1． 实验所需的主要仪器
PCR仪，琼脂糖电泳仪及电泳槽，凝胶成像仪，恒温水浴，恒温气浴培养箱，PH计。
2． 实验所需的试剂、耗材
耗材：1.5 ml EPPENDORF 离心管，0.2 ml PCR反应管，80mm 培养皿；牙签；
试剂：
PCR试剂：大麦的基因组DNA，Taq DNA 聚合酶及其反应缓冲液，PCR引物，dNTPs，无菌超纯水； （BSW1: CACCTCATCCAGGTTATTCA；BSW7: CATGATCGCGGTACATACAG）；
电泳试剂：琼脂糖，硼酸，Tris－base，100bp分子量标准带上样缓冲液；
DNA片段回收：琼脂糖凝胶DNA分离试剂盒；
载体及感受态细胞：p-GEM-T-easy 载体，及JM109感受态细胞；
培养基制备：BactoR 胰蛋白胨，酵母抽提物，NaCl；安苄青霉素，IPTG，X-GAL，DMSO（用于溶解X-GAL）；
转化子筛选试剂：EcoR I 限制性内切酶，质粒DNA提取试剂盒，PCR及电泳试剂，SP6和T7引物（订购即可）。
三. 实验材料：
大麦幼苗或提取的基因组DNA
四. 实验课主要内容：
本实验需要约24－30个学时，需连续进行，最好能够安排3天的时间，包括以下主要内容：
1．基因分离：利用PCR技术从大麦基因组DNA中克隆其α－淀粉酶基因片段；
2．凝胶电泳：用1％的琼脂糖电泳分离PCR产物，并回收目的片段（750bp和820bp），并利用琼脂糖凝胶DNA分离试剂盒回收目的片段；
3．基因片段与载体连接：由于PCR所用Taq DNA聚合酶具有在其产物的3ˊ末端加上一个腺苷酸（A）；故此可利用T－载体进行克隆。将所回收的目的片段与pGEM-T-easy载体连接。
4．大肠杆菌的感受态细胞制备与转化：大肠杆菌JM109感受态细胞制备采用CaCl2溶液处理的方法获得，采用热激法进行连接产物的大肠杆菌转化；转化后利用LB培养基进行恢复培养；
5．培养基与平板制备：JM109需用LB培养基进行培养，由于载体具有安苄青霉素抗性基因，且具有插入失活的α－互补机制，故培养基平板制备可添加安苄青霉素，进行筛选，同时可在转化后培养前在培养基表面涂ITPG和X-GAL来进行蓝白筛选。
6．转化细胞的筛选培养：转化细胞恢复培养1－1.5 小时后，涂平板培养过夜；
7．转化细胞的鉴定：由于pGEM-T-easy载体具有SP6和T7两个启动子，且两个启动子反向排列，因此可利用这两个启动子的引物通过PCR扩增来检测目的片段的插入，同时该载体在插入片段的两侧各有一个EcoRI的切点，因此也可对白色克隆进行培养，提取质粒DNA，然后利用EcoRI酶切来检测目的片段的插入。
总之，通过以上操作使学生掌握基因工程的基本过程，并通过这一实践加深学生对其主要流程的理解。
